转Bt基因抗虫作物培育现状及Bt蛋白的改造和聚合策略的利用

苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis，简称Bt，是目前产量最大、使用最广的生物杀虫剂。它的主要活性成分是一种或数种杀虫晶体蛋白 (Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)，又称δ-内毒素。随着基因工程技术的发展，越来越多的来自微生物的具有特殊功能的基因被转入到靶标作物中，从而提高作物抗胁迫的能力。转Bt基因作物的出现实现了人们防治害虫少打农药的夙愿，目前主要在防治鳞翅目有害昆虫棉铃虫和玉米螟等方面得到了成功应用。本文主要就转Bt基因作物研究及其应用领域的成就作一简要回顾与展望。

Bt基因存在于一种土壤微生物苏云金芽胞杆菌中，其具有抗虫功能的蛋白有多种类型 (Cry、Cyt和Vip)。早在20世纪初期苏云金芽胞杆菌就已经证明对鳞翅目昆虫有杀虫活性。随着对Bt菌株的不断发现和新Bt基因的不断克隆，Bt家族的成员也越来越多，其蛋白类型从Cry类扩展到Cyt和Vip类型，抗虫谱从鳞翅目扩展到双翅目和鞘翅目[1, 2, 3]。这些丰富的Bt基因资源为开发出应对各类害虫的Bt制剂和转基因作物提供了良好的基础。根据1997年的新分类方法，将所发现的176个Bt蛋白分为28群 (其中Cry蛋白26群，Cyt蛋白2群)，53类，89亚类。其中第一群 (Cry1A-类)为最大群，共11类33亚类[4]。目前 (2014年4月)，Bt蛋白已增至76群共778个成员，其中Cry蛋白73群，Cyt蛋白3群 (详细信息可查阅网站http://www. lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html)。

在植物中表达Bt基因进而开发转基因抗虫作物是Bt基因的一个重要应用领域而且发展势头异常迅猛。1987年，第一个转Bt基因植物——转Bt基因烟草诞生[5]，随后Bt基因被导入各类作物中。1995年，转Bt基因玉米、棉花和马铃薯3个作物首次在美国和加拿大实现了商品化[6]。2013年，全球转Bt作物种植面积维持在7 000万hm2以上。其中，包含Bt的两种或三种复合性状的转基因作物面积为4 700万hm2，占到了转基因作物总种植面积的26%。在中国，Bt抗虫棉是种植面积最大的转基因抗虫作物，2013年的种植面积达到了420万hm2，农民对Bt棉花的采用率达到90%[7]。对国际农业生物技术应用服务组织 (International service for the acquisition of agri-biotech applications,ISAAA)网站上的数据进行统计后发现，截至2013年11月，含Bt基因的转化事件中，通过了安全评估的累计共有347个，其中玉米中有255个审批通过的转化事件，以绝对优势位居第一 (表1)。通过商业许可的转基因作物也已经扩展到5个 (分别是玉米、棉花、水稻、马铃薯和茄子)，这些商业化抗虫作物绝大多数的开发者是国际上的大公司，这也表明在商业化作物开发上大公司具有更大的优势 (表2)。

玉米螟和水稻二化螟是造成玉米、水稻减产的主要害虫 (图1A−B)。近年来作者实验室一直从事抗虫基因表达与抗虫作物性状分析研究，先后利用组成型和绿色组织特异型启动子，表达了Cry1C、Cry2A以及Cry1Ab等多个Bt蛋白质，获得了多种抗虫转基因玉米和水稻株系 (图1E−F)，并希望最终获得杀虫效果良好的作物新种质。国际上抗虫作物研发的历程表明，通过不同Bt基因的聚合，不仅可以增强作物的杀虫效果，而且能够扩大杀虫谱，获得除抗螟虫外兼抗其他鳞翅目害虫或鞘翅目害虫 (例如粘虫、地老虎、蛴螬等) 的作物新品种。抗虫新品种的推广可以大大减少杀虫农药的使用，降低种植成本，成为实现绿色农业[8, 9, 10]、保证可持续发展的重要举措。

为了增强转基因作物的抗虫性，使转Bt作物在农业生产上的应用成为可能，研究者对具有较好杀虫能力的Bt基因进行了很多有效的改造。这些改造包括密码子的优化、选用好的调控元件和转化策略以及对Bt蛋白的修饰。

通过增加cry1Ab和cry1Ac基因的GC含量以及改为植物偏爱的密码子，转基因番茄和烟草中的Bt含量达到了总可溶蛋白的0.02%，比原来提高了100倍[11]。根据Cry1Ah基因所预示的氨基酸序列，将其DNA序列按照水稻密码子偏爱性设计了5种不同的密码子优化方案 (分别为将密码子全部替换 为每个氨基酸中的最高频密码子；只将稀有密码子转变为最高频密码子；按照密码子频率使用表中各密码子使用频率优化；将序列中的密码子换为中等频率的密码子以及使用每个氨基酸最高频的两种密码子)，通过分子手段分析后表明全部采用最高频率密码子的优化方案效果最好，Cry1Ah蛋白平均表达量可以占到可溶性蛋白的0.104％[12]。除了改造DNA序列外，利用强启动子以及合适的终止子，Cry蛋白含量可以增加到可溶蛋白的0.2%−1%[13]。而如果将密码子优化后的Cry1Ah蛋白转入到叶绿体中进行表达，其蛋白含量将比转入细胞核中还可以再增加10倍[14]。同时，由于转入叶绿体中的Bt蛋白将不会存在于花粉和籽粒中，这将进一步降低人们对转基因作物危害环境和人畜安全方面的担心，从而能够更好地增强Bt作物的商业价值。除了转录水平的提升，某些特殊的起始序列 (kozak，Ω) 和信号肽 (PR1a，KDEL) 具有增强基因翻译水平的作用，因而也可以起到增加表达效率，提高杀虫活力的作用[15]。

除了对基因进行密码子优化和选择增强表达的调控原件外，最近越来越多的研究集中在如何提高Bt蛋白本身的杀虫活力。经过各种尝试，现在看来可行的方法主要包括以下几种：氨基酸代换、功能域置换、在特定区域内引入蛋白酶识别或结合位点以及删除N端的部分序列。

将Cyt2Aa蛋白在Loop环结构位置处加入蚜虫肠道受体结合肽GBP3.1后可以使得这种修饰的Cyt2Aa除了具有对双翅目昆虫的抗性还获得了对同翅目昆虫蚜虫的毒性[16]。而昆虫中肠受体钙粘蛋白上的CR12-MPED多肽可以成为Cry1A类蛋白杀虫活力的增强剂[17]。蓖麻毒素作为一种毒蛋白与Bt蛋白类似，也是由毒性区 (A链) 和受体结合区 (B链) 组成。将蓖麻毒素B链中的半乳糖结合结构域与Cry1Ac融合后转化水稻和玉米，转基因植物都表现出了更强的抗虫性[18]。

获得中国农业部转基因安全证书的水稻品种华恢一号其抗虫基因cry1Ab/c，即为cry1Ab和cry1Ac的融合基因。具体讲就是把Cry1Ab的第一和第二个结构域保留，而把第三个结构域替换为Cry1Ac的第三个结构域而得到的融合蛋白[19]。因第一个结构域与蛋白毒性相关，第二和三个结构域与蛋白的结合能力有关，经过结构域之间的重新组合，可以使得新的蛋白同时具有高结合力和高毒性，从而增强了蛋白的杀虫活力。同样的，孟山都公司开发的转基因玉米MON89034，转入的基因命名为cry1A.105，实际上是将Cry1Ab的第一结构域，Cry1Ac的第二结构域和Cry1F的第三结构域进行了重新组装 (http://cera-gmc.org/index.php?evidcode% 5B% 5D=MON89034&auDate1=&auDate2=&action=gm_crop_database&mode=Submit)。另外将Cry1Ba截短后与Cry1Ia的第二结构域融合后可以产生对鳞翅目和鞘翅目昆虫双抗的效果[20]。

在Cry3A的第三个和第四个α-helices之间进行修饰，使之包含一个胰凝乳蛋白酶G识别位点，从而增强Bt毒性以及对玉米根虫中肠的特异识别[21]，而Cry3A与Cry1Ab融合后得到的蛋白eCry3.1Ab可以使得对玉米根虫的毒性变得更强[22]。将Cry3的N端第1−32位氨基酸删除，以获得或增强对玉米根甲虫的杀虫能力，或将Cry3的N端第32−33位氨基酸Val-Val替换为Gly-Pro-Gly-Lys，有助其N端氨基酸多肽在目标昆虫中肠中被昆虫中肠蛋白酶切除。改良后的Cry3A对西方玉米根虫和北方玉米根虫的杀虫能力远高于天然Cry3A，改良后的Cry3B对南方玉米根虫的杀虫能力远高于天然Cry3B[23]。

另外，利用体外分子进化技术诱导cry基因DNA序列的突变和蛋白结构域的重排，从而有目的地筛选新的高抗蛋白成为改造Bt蛋白的重要方法[24, 25]。通过易错PCR (Error-prone PCR) 将Cry1Ac这个应用已久的杀虫蛋白进行诱变，发现位于第三结构域的524位点上的苏氨酸变成天冬酰胺后，Cry蛋白对鳞翅目昆虫的杀虫活性显著增强[26]。这一发现不仅创造了一个具有商业化前景的新抗虫蛋白，还有助于更加明晰Cry蛋白的杀虫机理和各结构域的具体功能。同样，利用DNA shuffling技术诱变cry8Ka序列后筛选到了对棉花象鼻虫 (Cotton boll weevil，Anthonomus grandis) 这种鞘翅目昆虫有高活力的新杀虫蛋白[27]，拓宽了Bt蛋白的杀虫谱。随着分子生物学技术的不断发展，越来越多的新型Bt杀虫蛋白会被人工制造出来，为培育抗虫作物提供源源不断的候选基因资源。

作物害虫对转基因植物产生抗性是一个不容忽视的问题，它可能使已经开发的转基因作物毁于一旦。所谓基因聚合即在同种作物品种中转入两个不同的抗虫基因。发展基因聚合策略对于中国的农业具有特殊的意义。

McGaughey在1985年首次报道了实验室条件下印度谷螟对Bt制剂产生抗性[28]，而小菜蛾是发现的第一例在田间对Bt制剂产生抗性的昆虫[29]。随后在实验室或田间通过人工筛选已获得了大量抗性昆虫株系[30, 31, 32]。而真正在田间自然条件下对Bt作物产生抗性的昆虫是棉铃虫，抗性产生的时间发生在转基因作物开始商业化种植的6年后 (2002年)[33]。截止到2012年，田间发现的对Bt作物产生抗性的昆虫共有 5类，分别是棉铃虫Heliothis zea、草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda、棉红铃虫Pectinophora gossypiella、玉米茎蛀褐夜蛾Busseola fusca和玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera，涉及到的基因包括cry1Ab、cry1Ac、cry1F和cry3Bb[33]。

人工筛选抗Bt昆虫株系并揭示其抗性机理的相关研究也越来越多[34, 35, 36, 37]。这些研究不仅可以帮助我们对昆虫产生Bt抗性的潜在风险进行预测，而且可以指导我们寻找有效的方法延缓昆虫抗性的产生[38, 39, 40]。目前，治理昆虫抗性的产生主要有“高剂量/庇护所”和“基因聚合”两种策略。在美国、澳大利亚等国家主要采用高剂量/庇护所的方法来延缓昆虫产生抗性，但由于我国的主要目标害虫、种植制度、农户规模等生态和社会环境与这些国家有很大差异，这意味着在发达国家普遍采用的“高剂量/庇护所”策略在我国难以严格执行，因而“基因聚合”策略更符合我国的国情。

基因聚合策略要考虑两个基本原则：1) 每个基因单独都有极强的作用；2) 聚合后交叉抗性的几率低。这样，昆虫同时对两种不同蛋白产生抗性的几率就会大大降低。cry1Ac和cry2Ab的组合是现在应用最广泛、效果也很好的聚合策略，因为它们的氨基酸同源性很低且结合在昆虫中肠的不同位点，从而使得昆虫对它们产生交叉抗性的概率很低[36, 41, 42]。但是，最近研究者发现cry1Ac和cry2Ab组合的交叉抗性是非对称的 (Asymmetrical cross-resistance)，即：用Cry2Ab筛选的抗性株对Cry2Ab和Cry1Ac都具有抗性，而用Cry1Ac筛选的抗性株只对Cry1Ac具有抗性而对Cry2Ab没有抗性。虽然这一现象的机制还有待研究，但是却给我们应用这一基因组合生产长效抗虫转基因作物敲响了警钟，好在用Cry2Ab筛选出来的对Cry2Ab和Cry1Ac都具有抗性的抗性株其实在田间并不能存活于含有Cry2Ab+Cry1Ac的转基因棉桃上 (可能是由于田间和实验室内剂量以及条件的差异)[42]。不过，这也表明要想有效地延缓昆虫抗性的产生，除了选择合理的基因聚合策略外，保证蛋白的高剂量以及一定比例的庇护所也是需要的[41]。

除了Cry2Ab，Cry1A类蛋白和Cry1C、Cry2A、Cry9C的结合位点也是不同的[43]，同时Cry1C的抗虫效果又比Cry2A的效果好[44, 45, 46] (表3)，因此Cry1C和Cry1Ab (c) 也可以作为一种潜在的组合策略。

cry34Ab1/cry35Ab1是对西方玉米根虫Diabrotica virgifera非常有效的双价聚合基因，原因有两个：1) 两个基因都有着特殊的蛋白结构，这就避免了交叉抗性的出现；2) 结合位点的差异性且Cry34Ab1可以增强Cry35Ab1与受体的结合能力。用其生产的转基因玉米 (转基因事件event DAS-59122-7) 具有很好的抗根虫性状，现在已经被陶氏益农公司进行了商业化的生产[47]。

此外，对于防治亚洲玉米螟非常有效的Bt蛋白Cry1Ab来说，其与Cry1Ah间是存在着高度的 (131倍) 交叉抗性，其次是Cry1Ac (36倍的交叉抗性)，与Cry1F间的交叉抗性极低 (只有6倍)，而与Cry1-类的另外一个成员Cry1Ie间几乎完全没有交叉抗性[48, 49]。Cry1Ie蛋白在Bt菌株中沉默表达而在大肠杆菌中可以大量产生，其对鳞翅目昆虫尤其对亚洲玉米螟有很好的毒杀效果[50]。因此Cry1Ab与Cry1Ie也是一对具有潜在价值的基因组合。

在抗虫基因聚合的方法上，过去的聚合品种基本上都是以作物有性杂交的方式实现的 (简称杂交聚合)。这一方法的优点是构建载体和作物转化相对容易，而且可以根据需要灵活地选择组合策略。2010年在美国和加拿大上市的转基因玉米SmartstaxTM即为孟山都公司和陶氏公司通过有性杂交的方法将8个抗虫抗除草剂基因 (包括两个抗除草剂基因pat和epsps/cp4，4个抗鳞翅目昆虫的基因cry1A.105、cry1Ab、cry2Ab、cry1Fa和两个抗根部害虫的基因cry34Ab和cry35Ab) 聚合到一起，从而实现了对多种昆虫和除草剂的抗性[51]。但是，杂交聚合的策略也具有很多劣势，比如：田间杂交回交的工作量很大、多插入位点会带来位置效应等。另外，我国的转基因作物安全评价流程采用的是基于品种的评价流程，而非美国等国家所采用的基于转化事件的评价流程，这就使得聚合后的转基因品种要重新进行安全评价过程，无形中耗费了更多的时间和成本。因此一次性构建含有所有目标基因的转化载体然后直接转入目标作物中从而产生基因聚合的品种将是更好的选择。

多基因聚合载体转化植物的技术目前在研究代谢途径、制作生物反应器以及改良微效多基因控制的性状 (如作物产量) 方面具有很好的应用前景[52, 53, 54, 55, 56]。由于载体上元件的数量较多，传统的酶切连接的方法不仅繁琐耗时且会受到酶切位点的限制，Gateway技术利用位点特异重组系统使得表达元件在各载体间发生转移从而实现多基因元件的聚合。经过多年的发展和改善，这项技术的应用范围和构建效率逐步提高，也已经具有转化多种植物的应用实例[57, 58, 59]。最近一项研究表明，Gateway技术可以实现同时转入包含8个基因总计74 kb长度的DNA片段[60]。植物人工染色体技术的发展也为多基因聚合带来了另外的途径[61, 62]。利用特异位点重组技术将多个基因整合到人工染色体上再导入到作物中，不仅实现了基因的聚合，而且因为外源序列没有插入到植物本身的基因组上，从而避免了转基因沉默、插入失活等一系列问题[63, 64, 65]。

此外，最近发展起来的新型基因打靶和编辑技术，包括锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶 (TALENs)、规律成簇间隔短回文重复 (CRISPR)/Cas系统[66, 67, 68]，不仅可以在植物基因组改造和定点引入外源基因方面有很大应用前景，也可以在多基因聚合转化方面发挥极大的作用[69, 70]。

随着对Bt基因研究的深入以及人们对转基因作物接受程度的提高，Bt基因抗虫作物的种植规模会越来越大，抗虫的种类也会越来越多。同时，对Bt蛋白作用机理和昆虫抗性机理的逐步探究以及新的分子生物学技术的发明也会帮助我们更好地开发出具有长效市场价值的Bt抗虫作物新品种。这些优良的抗虫作物的大规模种植势必会大幅度降低化学农药的田间施用量，进而在降低农业成本、释放农村劳动力、减少环境污染和提高食品品质等方面发挥更加积极的作用。